熒光團是一種熒光染料，可作為蛋白質(zhì)、組織和細胞標記的熒光標記物，以供熒光顯微鏡進行檢測。熒光團的運作方式是吸收特定波長區(qū)域(又稱為激發(fā)能量范圍)的能量，然后在其他特定波長區(qū)域(又稱為發(fā)射能量范圍)內(nèi)重新發(fā)射該能量。
圖1：常見熒光團光譜曲線
一般來說，熒光團會被高頻率的照明(紫外、紫色或藍色光譜區(qū)域內(nèi)的波長)激發(fā)或吸收能量，然后會在頻率較低的照明(綠色、紅色或近紅外光譜區(qū)域內(nèi)的波長)中發(fā)射該能量。每種熒光團都具備了能夠吸收能量的波長，又稱為峰值激發(fā)波長λ (nm)，以及能夠?qū)⑺盏降亩嗄芰恐匦掳l(fā)射的對應波長，又稱為峰值發(fā)射波長λ (nm)。選擇單獨光學濾光片以及大透射的波長將能夠確保您獲得清晰度高的熒光圖像。
在熒光顯微鏡應用中，典型的熒光顯微鏡設置包含了三個濾光片。有關典型熒光顯微鏡設置，請參閱圖2。
濾光片一：激發(fā)濾光片
激發(fā)濾光片是放置于熒光顯微鏡的照明路徑內(nèi)。其目的是用于過濾光源中的所有波長，除了受檢測熒光團的激發(fā)能量范圍。濾光片的小透射(%)是決定圖像亮度和清晰度的關鍵。對于任何激發(fā)濾光片，我們光學建議使用的小透射為40%，理想的透射為>85%。激發(fā)濾光片的帶寬應*出現(xiàn)在熒光團的激發(fā)能量范圍內(nèi)，而理想的濾光片的中心波長(CWL)應盡可能與受檢測的熒光團的峰值激發(fā)波長的長度相近。
由于光密度(OD)是決定濾光片如何截止帶寬中波長的衡量標準，因此激發(fā)濾光片的光密度是圖像背景暗度的關鍵。我們光學建議使用的小光密度為3.0，理想的光密度為6.0。具備理想的中心波長、小透射(%)以及光密度的光學濾光片能夠提供清晰度高的圖像，而濾光片的深截止則能夠確保檢測到微弱的發(fā)射信號。
濾光片二：發(fā)射濾光片
圖2：典型熒光顯微鏡設置
發(fā)射濾光片是放置于熒光顯微鏡的成像路徑內(nèi)。其目的是用于過濾受檢測熒光團的整個激發(fā)能量范圍，以及透射該熒光團的發(fā)射能量范圍。對于發(fā)射濾光片，我們所建議的小透射、帶寬、光密度以及中心波長均與激發(fā)濾光片相同。同樣的，具備理想的中心波長、小透射(%)以及光密度的發(fā)射濾光片能夠提供清晰度高的圖像，而濾光片的深截止則能夠確保檢測到微弱的發(fā)射信號。
濾光片三：二向色性濾光片或分光器
二向色性濾光片或分光器是以45°角放置于激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片之間。其目的是用于將激發(fā)信號反射至受檢測的熒光團，然后將發(fā)射信號透射至檢測設備。理想的二向色性濾光片或分光器應能夠在大反射率和大透射率之間迅速過渡，激發(fā)濾光片帶寬的理想反射率為>95%，而發(fā)射濾光片帶寬的理想透射率為>90%。選擇濾光片時，應該將熒光團的相交波長(λ)考慮在內(nèi)，以確保獲得低雜散光和高信噪比的熒光圖像。
